Nature Biotechnology | 呕心沥血之作，David Liu系统总结基因编辑的综述（值得收藏)

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新的CRISPR–Cas基因组编辑工具的开发继续推动生命科学领域的重大进步。目前，可使用四类CRISPR-Cas衍生的基因组编辑器（核酸酶，碱基编辑器，转座酶/重组酶和Prime编辑器）来修饰实验系统中的基因组。这些编辑器中的一些也迅速进入了临床应用。每种工具都有其自身的功能和局限性，并且付出了巨大的努力来扩展其编辑功能，扩大其定位范围并改善了编辑特异性。

2020年6月22日，博德研究所David Liu团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors”的综述文章，该综述首先描述已表征的Cas9和Cas12核酸酶的天然变异体，并详细介绍具有扩大的靶向范围和特异性的Cas9和Cas12核酸酶变异体的开发。接下来，该综述讨论碱基编辑器的开发和应用，这些编辑器可精确安装点突变而无需双链DNA断裂（DSB）或供体DNA模板。最后，该综述总结了新兴的CRISPR–Cas基因组编辑工具，包括介导大片段DNA重排的Cas转座子和重组酶，以及主要编辑器，它们以取代原始DNA序列的方式直接将编辑后的序列复制到目标DNA位点。

另外，2020年6月12日，博德研究所David R. Liu团队在Cell 在线发表题为“Determinants of Base Editing Outcomes from Target Library Analysis and Machine Learning”的研究论文，该研究在哺乳动物细胞中38,538个基因组整合靶标上表征了11个胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器（CBE和ABE）的序列-活性关系，并使用所得结果训练了BE-Hive，这是一种机器学习模型，可准确预测碱基编辑基因型结果（R ≈0.9）和效率（R≈0.7）。

研究人员以≥90％的准确度纠正了3388个与疾病相关的SNV，其中包括675个等位基因，其“旁观者”核苷酸被BE-Hive正确预测，因此无法编辑。该研究发现了以前无法预测的C-to-G或C-to-A编辑的决定因素，并利用这些发现以≥90％的准确性纠正了174个病原性SNV的编码序列。最后，该研究利用BE-Hive的见识来设计新颖的CBE变体，以调节编辑结果。这些发现启发了碱基编辑，实现了以前难以处理的目标的编辑，并为新的基础编辑器提供了改进的编辑功能。

基因组编辑实验的目的是在细胞基因组的天然背景下，将目标DNA序列转换为新的所需DNA序列。在大多数情况下，期望以高收率获得单个序列产物，但是取决于应用，所编辑序列之间的异质性可能是可接受的。在设计实现预期序列转化的策略时，有必要考虑几个因素。

所需的编辑类型决定了适合的编辑器类别。常见的所需针对性编辑包括以下内容：（i）DNA碱基对的转换（即点突变），（ii）DNA碱基对的缺失，（iii）DNA碱基对的插入或（iv）以上联合的更改（包括DNA碱基对的替换）。不同类别的CRISPR–Cas编辑器介导这些类型的变化。也可能需要其他改变，例如DNA片段的倒置或染色体易位。可以根据序列改变的大小以及所需的效率和产物纯度进一步对所需编辑进行分类。

当前的CRISPR-Cas蛋白库与目标DNA序列结合的能力是第二个主要考虑因素。迄今为止，所有被DNA靶向的CRISPR-Cas系统的靶向都要求在靶DNA位置附近出现一个短序列，称为原间隔子基序或PAM。天然存在的CRISPR系统提供了多种PAM选项，并且开发出了更多经过工程改造的变体，它们具有更宽泛或改变的PAM兼容性。特定工具的最佳选择必须考虑到靶位点上PAM序列的可用性，同时要认识到并非所有基于CRISPR的工具都与所有PAM变异Cas蛋白模块兼容。大多数CRISPR编辑方法还要求PAM和所需编辑位置之间的核苷酸数在一定范围内。

最后，CRISPR–Cas工具的最佳选择和整体编辑策略也将取决于预期的应用。诸如细胞类型（例如细菌，酵母，哺乳动物癌细胞系或哺乳动物有丝分裂后细胞），细胞环境（例如细胞培养物，类器官或体内），试剂形式（例如质粒DNA，核糖核蛋白（RNP）复合物，mRNA或病毒载体等因素）和递送方法（例如，脂质介导，电穿孔，核转染或病毒感染）各自施加了不同的限制，以及对不良基因组修饰事件的不同倾向。

在本综述中，盘点了这些考虑因素并分析了最近的发展，这些进展已逐渐提高了基于CRISPR的基因组编辑技术的适用性和有效性。该综述首先描述已表征的Cas9和Cas12核酸酶的天然变异体，并详细介绍具有扩大的靶向范围和特异性的Cas9和Cas12核酸酶变异体的开发。

接下来，该综述讨论碱基编辑器的开发和应用，这些编辑器可精确安装点突变而无需双链DNA断裂（DSB）或供体DNA模板。最后，该综述总结了新兴的CRISPR–Cas基因组编辑工具，包括介导大片段DNA重排的Cas转座子和重组酶，以及主要编辑器，它们以取代原始DNA序列的方式直接将编辑后的序列复制到目标DNA位点。

参考消息：

https://doi.org/10.1038/s41587-020-0561-9

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