改进抗体药物选择性和安全性的抗体锁

与传统药物相比，单克隆抗体(MAb)由于特异性和较长的半衰期，主要靶向治疗恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应和慢性炎症。然而,长期应用会导致全身抗原的中和引起严重不良反应，改进抗体的选择性和减少严重不良反应仍然是一个迫切需要解决的问题。

生物医学杂志近期发表了台湾高雄医科大学学者的综述文章—Ab locks for improving the selectivity and safety of antibody drugs。

该文作者认为通过安装蛋白酶可裂解的抗体锁（Ab lock），发展pro-Abs是一种新型且先进的重组抗体策略, 在机体正常部位，有效地掩盖抗体的抗原结合能力，当pro-Ab到达蛋白水解酶过表达的患病组织，选择性打开抗体活性。综述讨论了不同抗体锁设计的策略和优缺点,特别是基于空间位阻和亲和肽设计的策略，希望开发不同的抗体修饰屏蔽方法，以利于抗体在疾病局部发挥效应,增强抗体长期治疗慢性疾病的疗效和安全性,甚至促使科学家开发“无成药性”靶点的抗体药物，满足医疗的需求。

首先介绍了单抗药物在全球的应用，1986第一个治疗性单抗Muromonab-CD3经美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗肾移植排斥反应，从那时起,单抗的全球销售和批准急剧增长，每年大约4个产品。截止到2019年12月， 79个产品在美国和欧洲被批准和销售,超过300个单抗在研发中。单抗市场预期以每年8%或更多速度继续增长，到2025年，全球销量估计近3000亿美元。然而，抗体药物的广泛应用也导致严重的毒副作用（表1），尤其是它清除了正常部位具有生理功能的靶抗原，如用于治疗内风湿关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎等的Infliximab单抗的应用增加了感染、恶性肿瘤的风险，还可导致贫血、血小板减少及免疫抑制等副作用。用于治疗多发性硬化症的Natalizumab单抗，可以导致过敏、进行性多灶性白质脑病（PML）、免疫抑制及肝中毒等副作用。治疗非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、肉芽肿及内风湿性关节炎等病的Rituximab单抗，可以引起感染、免疫抑制、肾毒性及PML等。Efalizumab、Alemtuzumab、Ipilimumab、Nivolumab、Trastuzumab等单抗也具有各种毒副作用。Muromonab-CD3、Rituximab、TGN1412、Alemtuzumab单抗甚至引起严重的细胞因子风暴，可导致死亡。单抗的这些毒副作用增加了额外的治疗，需要改善抗体的选择性，使其能区分正常组织和疾病部位，只作用于疾病部位的靶抗原，以提高治疗的安全性和有效性。

为了改善抗体的选择性，文献介绍了pro-Abs及不同的抗体修饰策略。pro-Abs安装有蛋白酶可剪切的抗体锁，抗体锁能干扰抗体结合抗原的能力，当到达蛋白酶过表达的疾病部位能选择性的“打开”抗体活性，只中和疾病部位的抗原，减少毒副作用（图1）。pro-Abs有两个重要的部分，一个是“屏蔽域”，能够阻挡与抗原的结合，一个是疾病相关蛋白酶的底物肽，将“屏蔽域”连接在抗体轻链或重链的N末端，这样就构成了抗体锁。表2显示了pro-Abs的不同修饰屏蔽策略，主要有基于空间位阻和亲和肽策略设计的抗体锁。

Fig.1 Schematic of pro-antibody selectively activated at the disease region by installing a protease-cleavable Ab lock.

①基于空间位阻设计的抗体锁类型包括以自身铰链区作为“屏蔽域”如Infliximab抗体（图2），用自体的IgG1铰链区构建抗体锁，覆盖在抗原结合部位，连接金属蛋白酶（MMP）底物肽构成pro-Ab，当这种抗体在炎症部位遇到蛋白酶MMP，底物的连接链被水解，抗体锁打开，特异性的中和疾病部位的抗原，阻止内风湿性关节炎的进展。这种设计具有应用广泛、减少免疫原性、减少抗独特型抗体对抗体药物的结合及中和等优点。②以卷曲螺旋域作为“屏蔽域”如Rituximab、Trastuzumab等抗体（图3），用富含亮氨酸和平行异二聚体的卷曲螺旋构成抗体锁，连接MMP底物肽形成pro-Ab，到达炎症部位，螺旋域解离，抗体中和靶抗原。这种螺旋域可以来自新设计的或天然的人蛋白质，这种设计具有应用广泛、较好的屏蔽效果和高效的释放效率等优点，但是相对复杂的结构和定制的突变螺旋导致产量减少，长期使用增加了免疫原性诱导的风险。③以非抗体蛋白片段作为“屏蔽域”，如Cetuximab、Infliximab抗体以TGF-β潜伏相关肽（LAP）通过MMP-2的底物连接链连接在抗体重链的N末端，屏蔽抗原结合位点，减少抗-EGFR Ab 和抗-TNF-α Ab的结合能力，当被致病部位的MMP-2酶解连接链之后，抗原结合能力重新恢复（图4）。这种方法减少了宿主的免疫原性，因LAP域没有其他的生物学功能，减少了副作用或交叉反应，但是屏蔽效率较差，产量低，限制了的进一步研究和应用。

Fig.2 The autologous hinge domain as a universal Ab lock for enhancing disease site selectivity and minimizing the on-target toxicity of Ab drugs.

Fig.3 The coiled-coil domain as a universal Ab lock for enhancing the selectivity of Ab drugs to the disease site.

Fig.4 Endogenous LAP peptide is a widely applied Ab lock for enhancing the selectivity of Ab drugs to the disease site

1.以抗体片段作为“屏蔽域”，Metz等构建了一种三价双特异性抗体，通过蛋白酶底物肽将一个二硫键稳定性可变区片段（dsFv）连接在抗体1重链的C末端，dsFv可以结合c-Met抗原，但是它的抗原结合能力被抗体1的Fc端阻挡，只有被蛋白酶水解才能恢复抗原结合能力（图5a）。Onuoha’s 和Pai’s团队构建了一种可激活的双可变域抗体(aDVD)，将来自抗ICAM-1 或抗-PSCA 的dsFv通过MMP-1或MT-SP1酶底物肽连接到另一抗体(Infliximab 或 Adalimumab)的轻链和重链的N末端，dsFv掩盖了内部抗体与抗原的结合，当aDVD到达疾病部位，被酶切活化，恢复内部抗体中和抗原的能力（图5b）。

Fig.5 Ab fragment as an Ab lock for shielding antigen binding ability of specific Ab drugs.

2. 基于亲和肽设计的抗体锁①亲和肽 CytomX公司将从噬菌体抗体库筛选的亲和肽通过底物肽连接在抗体的抗原结合部位，掩蔽抗体（抗-EGFR , 抗-VCAM-1 或抗-EGFR ADC抗体）的抗原结合活性，制备了ProAb，当到达蛋白酶丰富的微环境时，酶解底物肽，恢复活性（图6）。然而由于亲和性限制了肽从Pro-Ab的释放效率，以及肽的异源性增加了免疫反应的危险性，这种定制肽也限制了它的广泛应用。②交叉隐蔽抗体

Donaldson等设计了交叉屏蔽的方法可同时掩蔽两种抗体，一个抗体通过蛋白酶底物肽连接另一个抗体的突变抗原表位（如突变的sEGFRdII），反之亦然（图7）。这种突变隐蔽表位有效的减少了连接的抗体对特异性抗原的结合，增加了蛋白酶剪切后的释放效率，以恢复抗体的中和活性。同时具有针对肿瘤不同抗原的两种抗体，可以增加疗效。但是由于较低的隐蔽效率，结构的复杂性，定制突变抗原及不可预知的释放效率等限制了其应用。③二价肽双链DNA偶联物 Janssen等构建了一种蛋白酶可激活的二价肽双链DNA偶联物作为屏蔽分子阻止抗体结合抗原，这个屏蔽分子具有2个抗体结合表位并通过蛋白酶底物肽将其结合到一个杂合双链DNA上，到达疾病部位，经酶切后，隐蔽的分子被释放，抗体活性恢复。然而，由于较低的隐蔽效率、异质性、定制的隐蔽表位、免疫原性及不确定的释放效率等因素限制了其应用（图8）。

Fig. 6 Affinity peptide-based Ab lock for masking the antigen binding activity of Ab drugs

Fig.7 Cross-masking antibodies for limiting off-target effects of Ab drugs.

Fig.8 Bivalent peptide-double strand DNA (dsDNA) conjugates as affinity-based Ab lock for blocking antigen binding ability of Ab drugs.

比较了Pro-Abs的不同屏蔽策略（表3），基于空间位阻设计的抗体锁如自体铰链区、卷曲螺旋域、LAP域或抗体片段，具有屏蔽效果好，释放效率高、抗体活性恢复好，应用广泛等优点。基于亲和性策略设计的抗体锁如亲和肽或突变抗原，具有可接受的屏蔽效率，但是需要定制屏蔽肽和不确定的释放效率使其不适合临床应用。用人造的卷曲螺旋域、外来的抗体片段及突变抗原等制备的抗体锁因免疫原性具有一定危险性。本质上，这两种策略都能阻止抗同种异型抗体的中和和清除。总之，不同屏蔽策略具有不同的优势，为研制针对不同疾病的下一代抗体药提供选择。

疾病状态时过表达的蛋白酶在Pro-Ab工作时起重要作用，蛋白酶水解Pro-Ab的底物肽，解锁抗体活性，发挥针对性靶标作用，表4显示了不同疾病时过表达的蛋白酶及在抗体药物中的应用。

Pro-Ab除了能够针对性治疗外，还可以避免抗同种异型抗体的中和及清除作用，但不同的抗体锁具有不同的屏蔽效率，同一抗体锁安装在不同抗体上屏蔽效率也不同，可通过计算机模拟技术进一步改善Pro-Ab的屏蔽效果。

总之，单克隆抗体因其高度的特异性、亲和性及半衰期长的优势，是目前发展最为迅速最有价值的治疗药物，当前最紧要的问题是改善其选择性，使其能区分疾病部位和正常部位的靶抗原，减少副作用，提高安全性和疗效。抗体锁屏蔽技术改进了抗体的反应性，提高了慢性疾病长期使用的疗效和安全性，还可以预防抗独特型抗体的干扰, 还可促进下一代抗体的研发。

参考来源：

Lin et al. Ab locks for improving the selectivity and safety of antibody drugs. Journal of Biomedical Science (2020) 27:76 https://doi.org/10.1186/s12929-020-00652-z

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